細(xì)胞凍存

細(xì)胞凍存是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)常規(guī)步驟，是細(xì)胞保存的重要方法之一。將細(xì)胞低溫保存在-196℃液氮中，使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長狀態(tài)而進(jìn)入休眠階段，以便日后復(fù)蘇重新培養(yǎng)擴(kuò)增。

細(xì)胞凍存方法

細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)，在往期文章中也有提到

保姆級細(xì)胞凍存方法

看似簡單的實(shí)驗(yàn)，仍有一些關(guān)鍵點(diǎn)需要格外留意，切莫踩到“雷區(qū)"，造成“實(shí)驗(yàn)大翻車"。

凍存操作前：

選擇長勢良好、存活率高，且生長密度在80%—90%的細(xì)胞進(jìn)行凍存。

需對細(xì)胞進(jìn)行雜質(zhì)檢測：是否有雜細(xì)胞或者支原體等雜質(zhì)。

這里推薦使用MB支原體常規(guī)法PCR檢測試劑盒，非定量檢測，常規(guī)PCR即可滿足需求，方便快捷，靈敏度高。

所用凍存試劑DMSO應(yīng)為分析級，避光儲(chǔ)存。

凍存前一日，對需保存的細(xì)胞進(jìn)行換液處理。

凍存操作

配制凍存培養(yǎng)基（常規(guī)含量）：DMSO含量5-10%，血清含量20%左右。

用凍存培養(yǎng)基將離心后的細(xì)胞進(jìn)行重懸。

分裝至無菌凍存管中。

梯度降溫：

4℃ 10 分鐘

?

-20℃ 30 分鐘

?

-80℃ 16～18 小時(shí)

?

液氮

或?qū)⒀b有細(xì)胞的凍存管，置于程序降溫盒中，放入-80℃冰箱中，一天后轉(zhuǎn)移至液氮中。

液氮的液相儲(chǔ)存與氣相儲(chǔ)存

一般認(rèn)為：-196℃的液氮，對于需要長期保存的細(xì)胞而言，是一比較合適的環(huán)境。因此，我們會(huì)將裝有細(xì)胞的凍存管，放入專用的方形凍存盒中，再裝進(jìn)液氮罐配套的提籃提籃中，浸入液氮的液相中進(jìn)行保存。

但在液相中長期儲(chǔ)存，容易面臨以下問題：

如果凍存管在罐內(nèi)密封不嚴(yán)，則會(huì)引起液氮滲入管內(nèi)，灌滿整個(gè)樣品管，造成樣品的污染。不僅如此，在取出凍存管的時(shí)候，液氮沸騰氣化使管內(nèi)氣壓升高，發(fā)生炸裂，容易傷到實(shí)驗(yàn)人員。

因此，有人提出，可以將細(xì)胞置于液氮的氣相中進(jìn)行儲(chǔ)存。

液氮罐內(nèi)溫度較比液相儲(chǔ)存高，一般在-135℃至-190℃，對于細(xì)胞儲(chǔ)存而言，該溫度也符合要求，但在實(shí)際操作過程中，也存在一定弊端：

與液相液氮罐相比，氣相液氮罐，在相同體積的液氮中保存時(shí)間更短，需對液氮罐內(nèi)的溫度進(jìn)行監(jiān)控，及時(shí)補(bǔ)充液氮來維持罐內(nèi)溫度。

所以，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)條件等情況，合理選擇液相儲(chǔ)存或是氣相儲(chǔ)存。在正確操作的前提下，這兩者都能達(dá)到比較好的凍存效果